Evaluación de la síntesis de polihidroxialcanoato (PHA) por Pichia sp. Levadura TSLS24 aislada en Vietnam

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3137 (2023) Citar este artículo

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Tras la creciente preocupación por los problemas ambientales causados por los plásticos convencionales de origen fósil y el agotamiento de los recursos de petróleo crudo, los polihidroxialcanoatos (PHA) son de gran interés para los científicos y el mercado de polímeros biodegradables debido a sus excelentes propiedades que incluyen una alta biodegradabilidad en diversas condiciones y flexibilidad de procesamiento. Se han investigado muchos microorganismos sintetizadores de polihidroxialcanoato, incluidas bacterias normales y halófilas, así como algas, por su desempeño en la producción de polihidroxialcanoato. Sin embargo, hasta donde sabemos, todavía hay estudios limitados sobre levaduras marinas productoras de PHA. En el presente estudio, se investigó una cepa de levadura halófila aislada de la isla Spratly en Vietnam por su potencial en la biosíntesis de polihidroxialcanoato cultivando la levadura en medio de agar marino Zobell (ZMA) que contiene tinte rojo del Nilo. La cepa se identificó mediante análisis de ADNr 26S como Pichia kudriavzevii TSLS24 y se registró en la base de datos Genbank con el código OL757724. La cantidad de polihidroxialcanoatos sintetizados se cuantificó midiendo los materiales intracelulares (predichos como poli (3-hidroxibutirato) -PHB) mediante método gravimétrico y posteriormente confirmado mediante análisis espectroscópicos de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) y espectroscópicos de resonancia magnética nuclear (RMN). En condiciones óptimas de crecimiento de 35 °C y pH 7 con suplementación de glucosa y extracto de levadura a 20 y 10 gL-1, la cepa aislada alcanzó un contenido de poli(3-hidroxibutirato) y una concentración de 43,4 % y 1,8 gL-1 después de 7 días. de cultivo. El poli(3-hidroxibutirato) producido demostró una excelente biodegradabilidad con una tasa de degradación del 28% después de 28 días de incubación en agua de mar.

Los plásticos biodegradables son productos plásticos que pueden ser degradados por organismos vivos como levaduras, hongos, bacterias, actinomicetos y otros bajo ciertas condiciones cuando se liberan en ambientes naturales. La demanda de plásticos biodegradables está aumentando actualmente debido a su prometedora capacidad para mitigar los problemas de contaminación causados por los plásticos derivados del petróleo convencionales. Por lo tanto, se han informado muchos estudios sobre bioplásticos, incluido el ácido poliláctico (PLA) y los polihidroxialcanoatos (PHA). Entre los diversos tipos de bioplásticos, los PHA pueden ser sintetizados biológicamente y degradados por completo por microorganismos incluso en condiciones salinas, como en el agua de mar1. Además de su biodegradabilidad y propiedades de compostaje, los PHA tienen un potencial prometedor para la producción a escala industrial, ya que pueden convertirse fácilmente en diferentes formas con las características deseadas debido a su gran variabilidad en la estructura2. Demostraron potenciales prometedores en aplicaciones médicas y producción de adhesivos, películas, productos moldeados, revestimientos de papel, embalajes, telas no tejidas y aditivos de rendimiento3.

En la naturaleza, los PHA se acumulan principalmente en el interior de los microorganismos en forma de partículas insolubles en el citoplasma. Tras el desequilibrio de nutrientes debido al exceso de fuentes de carbono o a la deficiencia de fuentes de nutrientes, como nitrógeno, fósforo, azufre o incluso oxígeno, los PHA con alto peso molecular (que contienen 103-104 monómeros, 0,2-0,5 µm de tamaño y el número de partículas es de 5 a 13 partículas/célula) se formaría por el sistema enzimático intracelular mediante la transferencia de una fuente de carbono4. Estas partículas insolubles sirven como almacenamiento de carbono y reserva de energía de la célula, lo que no influye en la presión osmótica celular incluso cuando se acumula en altas concentraciones1. Se han realizado muchos estudios sobre varios tipos de bacterias productoras de PHA, incluidas Pseudomonas, Bacillus, Alcaligenes, Azotobacter, Burkholderia, así como bacterias halófilas como Halomonas, Haloferix5,6.

Las levaduras son huéspedes potenciales para la producción de polímeros de PHA, ya que pueden utilizar sustratos económicos como fuentes de carbono y pueden modificarse genéticamente fácilmente7. Además, también tienen buena tolerancia a altas concentraciones de azúcares y ácidos orgánicos. Se ha informado que las levaduras Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica y Pichia pastoris son capaces de sintetizar PHA de cadena corta (como poli(hidroxibutirato), PHB) y de cadena media a partir de glucosa5,6,8,9, 10. Además, también existen estudios sobre cepas de levadura genéticamente modificadas para la producción de PHA, incluidas Y. lipolytica11,12, S. cerevisiae13,14,15, Rhodotorula minuta RY411, Kebeckera spp.16 y P. pastoris17, aunque los rendimientos son insatisfactorio para la producción a gran escala. Los microbios pueden acumular PHA hasta el 90% de su peso celular seco y mejorar la producción de PHA, y las características se pueden lograr mediante modificaciones en los tipos de sustratos, estrategias de alimentación, condiciones de cultivo y/o manipulaciones genéticas18. Sin embargo, no hay muchos estudios sobre los PHA. producción por cepas de levadura de tipo salvaje, especialmente levaduras halófilas10. Por lo tanto, es necesario investigar el potencial de cepas de levaduras halófilas aisladas del medio marino como hiperproductoras de PHA.

Pichia es un género de levadura popular que se puede encontrar en el suelo, cáscaras de frutas y otros ambientes, y que tiene la capacidad de proteger las frutas del daño e inhibir el desarrollo de hongos. Como la Pichia posee una excelente tolerancia a las altas concentraciones de glucosa y generalmente se reconoce como segura (GRAS), se ha aplicado en la fermentación de etanol para la producción de cerveza y vino. Además, la Pichia tiene una competencia prometedora en la producción de PHA y se ha informado que puede acumular un alto contenido de PHA de hasta el 78,9 % en condiciones óptimas de crecimiento19. El propósito del presente estudio es investigar la levadura que acumula PHA aislada de la isla Spratly, Vietnam, identificar la estructura del PHA obtenido; optimizar varios parámetros que influyen en la producción de PHA de levadura y demostrar la degradabilidad del biopolímero producido. Los resultados pueden dar una pista para producir PHA biodegradable a gran escala para reemplazar el plástico químico en un futuro próximo en Vietnam.

Se recolectaron muestras de sedimentos cerca del área de tratamiento de desechos ganaderos de la isla Spratly, Vietnam, en 8° 38′ 46,58″ N–111° 55′ 21,07″ E.

Los productos químicos y los medios para los experimentos fueron de Sigma y Merck Chemical Co., Alemania, si se indica específicamente lo contrario.

Se añadió un gramo de muestra de sedimento a 100 ml de agua esterilizada y se mezcló antes de diluirlo a 10-4 o 10-5 veces. Se utilizó medio agar marino Zobell (ZMA) (Hi-Media) para aislar levaduras halófilas. Se preparó medio ZMA en agua de mar (90%, v/v) suplementada con 2 gL-1 de sacarosa para enriquecer el crecimiento de la levadura y las placas de dilución se incubaron a 30 °C durante 72 h. Las distintas colonias viables se tiñeron con 0,5 mg L-1 de rojo Nilo y se observaron después de 48 h bajo luz ultravioleta a una longitud de onda de 235 nm. Las colonias de color rosa o naranja se consideraron cepas de levadura productoras de PHA. Esas cepas se seleccionaron para ser subcultivadas de forma independiente y sus reservas de glicerol se prepararon y conservaron a 4 °C para su uso posterior20.

Las cepas seleccionadas se cultivaron en medio líquido ZMA suplementado con 10 gL-1 durante 48 h. Luego, el cultivo se complementó con 1 ml de 0,5 mgL-1 de rojo Nilo y se incubó a 37 °C durante 1 h. El cultivo se centrifugó para eliminar el sobrenadante. El sedimento de biomasa se untó en portaobjetos y se observó bajo un microscopio de fluorescencia Axioplus (Carl Zeiss, Alemania) con un aumento de 40 veces, una longitud de onda de excitación de 550 nm y una longitud de onda de emisión de 570 nm. Los gránulos de PHA acumulados en las células mostraban un color naranja10. También se observó la morfología celular.

La colonia purificada se utilizó para la extracción total de ADN mediante un kit (Chromous Biotech Pvt Ltd, Bangalore, India). Se secuenció el ADNr 26S parcial y se completaron la secuencia transcrita interna (ITS) 1, 5.8S, ITS2, incluidas las regiones del dominio (D) 1 y D2 de la subunidad grande (LSU). Las secuencias de ADNr 26S se multiplicaron utilizando los cebadores universales ITS1 (5′TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′) e ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) mediante un termociclador de PCR (Mycycler, Alemania). ). Posteriormente, el producto de la PCR se purificó utilizando el kit de limpieza PCR SV (GeneAll ExpinTM, Corea). La concentración de ADN se midió con un equipo nanodrop (Colibri 75173, Alemania) y las secuencias se analizaron con una máquina de secuenciación Sanger (Alemania). La secuencia del gen 26S rDNA se comparó con secuencias de levadura relacionadas utilizando NCBI Mega BLAST para su identificación por pares. La nueva secuencia fue registrada en GenBank (NCBI). Se utilizó el software CLUSTAL-W para alinear las múltiples alineaciones de estas secuencias. Se utilizó el método de unión de vecinos para construir el árbol filogenético utilizando el software de visualización de árboles X21.

Los aislados se cultivaron en un volumen de trabajo de 100 ml de medio ZMA suplementado con diferentes concentraciones de NaCl, incluidas 2, 3, 5, 7, 10 y 12% con una concentración de inoculación inicial similar (OD600 nm = 0,3). El cultivo se realizó en una incubadora rotatoria a 30 °C durante 48 h. El crecimiento de la biomasa se observó midiendo la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm en diferentes períodos de 0, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 y 48 h después del cultivo. Se utilizó medio ZMA puro como control.

Una vez finalizado el cultivo, se centrifugaron 50 ml de medio de cultivo a 7000 rpm durante 10 minutos a 4 °C para obtener un sedimento de biomasa. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento de biomasa se lavó dos veces con agua destilada y se secó en una estufa de aire caliente a 55 °C, luego se pesó en una báscula para medir el peso seco de la biomasa (m1). El resto del medio de cultivo se centrifugó para la extracción de PHA. Los sedimentos celulares se disolvieron en una solución de NaClO al 5% y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Luego, se agregaron 50 ml de cloroformo y la solución se incubó a 37 °C durante 1 h más. Posteriormente, la solución se centrifugó para eliminar la fase superior. La fase inferior que contenía PHA se diluyó luego en cloroformo y se complementó con un volumen similar de mezcla de metanol helado (relación 9:1) (v/v) para la precipitación de PHA. Luego, la solución que contenía PHA precipitados se agitó durante 2 minutos y se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento de PHA se secó a 40 °C. Se midió el peso de PHA purificado (m2). El contenido de PHA se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Los grupos funcionales presentes en el PHA extraído se evaluaron utilizando un espectrómetro FT-IR Spectrum Two (PerkinElmer, Inglaterra). Brevemente, se diluyó 1 mg de PHA en 7 ml de cloroformo y se superpuso 1 gota de la mezcla sobre un disco FTIR KBr. La frecuencia del espectro infrarrojo (IR) se leyó en un rango de 400 a 4000 cm-1 con una resolución espectral de 4 cm-1 en presión de vacío22.

La estructura química del compuesto extraído producido por el aislado se identificó mediante análisis espectroscópico de RMN de protones. La muestra se preparó disolviendo PHA extraído (6 mg) en 0,5 ml de cloroformo deuterado (CDCl3). Los espectros de RMN 1H y RMN 13C se registraron a 125 y 400 MHz utilizando un espectrofotómetro de RMN Bruker Advance III (Harwell, Inglaterra). Para esta investigación se utilizó la temperatura de la sonda (25 °C) y tetrametilsilano como estándar interno23.

El sistema de análisis consta de un cromatógrafo de gases GC 8000 (Fisons Instruments, Mainz, Alemania) equipado con una columna DB5 ms de 30 m (película de 0,25 mm por 0,33 μm; J&W Scientific, EE. UU.) y un detector selectivo de masas MD 800 (Fisons Instruments ) funcionando a 70 eV o un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ 700 (Finnigan Corp., San José, California) operado en un modo de cuadrupolo único (Q1). Se aplicó un programa de temperatura de 60 a 290 °C (10 °C/min) para separar los fragmentos de estructura en la columna24.

La pureza del PHA se determinó mediante el método del ácido crotónico25,26. En resumen, se agregaron 5 mg de la mezcla extraída de PHA a 10 ml de H2SO4 concentrado y luego se hirvieron a 100 °C durante 30 minutos para convertir el PHA en ácido crotónico. La curva de calibración estándar de ácido crotónico se construyó utilizando un estándar de PHA puro adquirido en Sigma. La cantidad de PHA en la mezcla de extracción se determinó comparando la cantidad de ácido crotónico producida con la de la curva de calibración estándar. También se empleó un control negativo utilizando una solución de H2SO4 sin adición de PHA. La pureza del PHA se calculó como el porcentaje de PHA derivado de levadura en comparación con la curva de calibración del estándar de 5 mg de PHA27.

Varios factores que influyen, incluida la temperatura (15, 20, 25, 30, 35 y 40 °C), los valores de pH (4, 5, 6, 7, 8 y 9), las fuentes de carbono (glucosa, manitosa, lactosa, almidón, sacarosa) , se optimizaron las fuentes de nitrógeno (peptona, extracto de levadura, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio, urea) para obtener las condiciones óptimas para el crecimiento de la levadura y la producción de PHA. También se investigaron los efectos de la limitación de nitrógeno en la producción de PHA por levaduras marinas utilizando fuentes de carbono y nitrógeno seleccionadas. Se investigaron diferentes proporciones de carbono/nitrógeno (C:N, p/p) en el rango de 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1 y 80:1 para identificar las relación óptima C:N. Todos los experimentos de cultivo se realizaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml con un volumen operativo de 100 ml durante 72 h a 30 °C en una incubadora rotatoria. El contenido máximo de PHA (%) y la concentración de PHA (gL-1) producidos por la cepa de levadura se alcanzaron en función del peso seco celular total (gL-1). Además, el cultivo de levadura se realizó en diferentes volúmenes operativos, incluidos 200, 500, 1000, 2000 y 5000 ml para obtener un volumen adecuado para la producción de PHA.

La película de PHA se formó disolviendo el PHA obtenido en cloroformo suplementado con 4% de PEG (para reducir la dureza de la película) y luego la solución se vertió en placas de Petri de 9,8 mm de diámetro. Las placas de Petri se dejaron en la campana para permitir la evaporación del disolvente para formar una película de PHA. Luego se incubó la película de PHA con un espesor de 0,035 mm, un área de 75,4 mm2 y un peso de 1 g/l en un medio que contenía 5 g/l de glucosa, 1 g/l de extracto de levadura y agua de mar (NaCl al 3%) en matraces. Se sometieron a este experimento tres grupos, incluido un grupo de control que utilizó agua de mar esterilizada, un grupo que utilizó agua de mar natural (para observar la bioatenuación del consorcio de microorganismos naturales en agua de mar) y un grupo que utilizó agua de mar esterilizada suplementada con Pichia sp. . sí mismo con la concentración de inoculación inicial del 0,5%. Se incubaron matraces de los 3 grupos durante un total de 28 días a 30 °C y 200 rpm para investigar la biodegradabilidad de las películas de PHA. Las películas de PHA se pesaron gravimétricamente al inicio y después de 28 días. La estructura de las películas antes y después de la descomposición se analizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).

El SEM se utilizó para observar la topología de la superficie de las películas de PHA. Las películas se colocaron en soportes de muestras (cubiertos con cintas de carbono), luego se colocaron en el sistema SEM JEOL JSM6400 y se analizaron siguiendo los manuales del fabricante22.

Todos los experimentos se realizaron por triplicado (n = 3). El análisis estadístico de los resultados se realizó utilizando el paquete de software estándar de Microsoft Excel. Los resultados se representaron como media con desviación estándar (media ± DE). La significancia entre medias probadas mediante la prueba t de Student fue de p < 0,05.

Los microorganismos fueron considerados como fábricas de células para la producción de polihidroxialcanoatos28. A partir de muestras de sedimento recolectadas, se aisló una cepa de levadura halófila denominada TSLS24 utilizando medio ZMA. Al utilizar tinción con rojo del Nilo y observar bajo microscopía de fluorescencia, la cepa TSLS24 tenía fluorescencia naranja, entonces podría ser un organismo productor de PHA (Fig. 1a). La morfología de la cepa de levadura TSLS24 era marfil, colonias con un margen completo, superficie circular, convexa y ligeramente rugosa con un tamaño de colonia de aproximadamente 2 a 3,5 mm de diámetro. La cepa no excreta ningún pigmento al medio de cultivo. Las células TSLS24 son largas, de forma ovalada y tienen un polo en gemación. La celda tiene un tamaño aproximado de 4,0 a 10,0 × 2,5 a 5,5 µm.

(a), levaduras productoras de PHA TSLS24 bajo microscopía de fluorescencia; (b), árbol filogenético construido mediante el método de unión de vecinos basado en el dominio D1/D2 de secuencias del gen ARNr 26S (LSU) de especies cercanas, mediante el software MEGA-X con análisis de unión de vecinos, indica la posición de los aislados G1- 4(1) y G1-12(3). El valor de Bootstraps (%) se basó en 1000 replicaciones.

La secuencia del gen 26S rDNA de TSLS24 relacionada con las de las secuencias de levadura vecinas se realizó empleando NCBI Mega BLAST para su identificación por pares. El análisis filogenético se evaluó con base en la secuencia parcial del ADNr 26S y la secuencia completa del gen del ARN ribosómico ITS 1, 5.8S, ITS 2 y del gen del ARN ribosómico LSU de TSLS24. Estos resultados confirmaron que el genoma de TSLS24 coincide más estrechamente con el género Pichia kudriavzevii con una singularidad destacada (100%), similar a un género registrado previamente Pichia kudriavzevii Y-5396 T (GenBank: EF550222). El aislado fue denominado Pichia kudriavzevii TSLS24 y registrado en GenBank con el número de identidad OL757724. Se utilizó el software CLUSTAL-W para afiliar múltiples alineamientos de estas secuencias y el árbol filogenético se insinuó utilizando el método de unión de vecinos (Fig. 1b). La morfología de TSLS24 es análoga a la de P. kudriavzevii HOP-1, que se describió como de color blanquecino a crema con superficie elevada y tamaño ovalado, de elipsoidal a alargado según SEM29. Se afirmó que varias especies de levaduras tenían la capacidad de producir PHA, como Candida bombicola30, Candida tropicalis BPU131, etc. Sin embargo, muy pocas Pichia sp. fue reportado como un buen productor de PHA19. Pichia kudriavzevii VIT-NN02, aislada del manglar marino en 24 Parganas, Sundarban indio, donde la salinidad aumenta hasta un 30% durante todo el año, fue reconocida como un productor potencial de PHA19. También se encontró que Pichia kudriavzevii es una levadura productora de bioetanol que podría usarse para la fermentación a escala piloto32).

Para evaluar la tolerancia salina del TSLS24, se estableció un rango de concentraciones de NaCl que incluye 2, 3, 5, 7, 10 y 12%. Según Quillaguamán et al.33 y Kourmentza et al.34 las cepas tolerantes a la solución salina o halófilas podrían usarse para obtener PHA mediante shock hipoosmótico en lugar de utilizar solventes. Se considera que los microorganismos halófilos podrían usarse como biocatalizadores para la producción industrial de PHA33,34. Los resultados mostraron que el cultivo de Pichia sp. TSLS24 en medio ZMA suplementado con NaCl al 7% logró la concentración de biomasa óptima de OD600 de 2,2 ± 0,2 después del cultivo durante 48 h (OD600 inicial nm = 0,3), igualmente a 1,15 ± 0,14 (g/L). Por otro lado, el cultivo con NaCl al 10% arrojó una DO600 de 1,5 ± 0,2, igual a 0,88 ± 0,06 (g/L). No hay crecimiento de levadura inoculada en medio suplementado con NaCl al 12%. Por lo tanto, se determinó que el aislado es una levadura halófila que puede tolerar concentraciones de NaCl de hasta el 10%. Se informaron varias cepas de bacterias halófilas como productoras de PHA, incluidas Halomonas sp.35, Haloferax mediterranei8, Alsafadi et al.9, Halogeometricum borinquense36 y otras. Sin embargo, los estudios sobre cepas de P. kudriavzevii productoras de PHA halófilas son limitados. Por tanto, los resultados obtenidos proporcionan más información sobre la producción de PHA de Pichia.

El PHA extraído de Pichia sp. TSLS24 se analizó mediante FT-IR en comparación con el estándar PHA (Sigma). Los espectros que se muestran en las figuras 2a, b revelaron que la banda de absorción apareció a 3441 cm −1, lo que representa la flexión O – H. La naturaleza amplia y el valor más bajo de frecuencia indicaron que el OH tiene enlaces de hidrógeno libres. Los picos prominentes en 2854 cm-1 y 2934 cm-1 mostraron influyentes grupos de alcanos que estiran –CH2 y –CH3. El pico de 1720 cm-1 fue el grupo de alargamiento C = O del grupo éster en el PHA. El grupo –CH(CH2)2– se presentó en el pico de 1379 cm−1. Se observaron enlaces de estiramiento de alcanos (C-H) a 1278 cm-1. Se produjeron dos fuertes enlaces de estiramiento C-O a 1100 cm-1. Ojha y Das19 informaron un resultado similar, donde se exhibió un análisis FTIR de PHA de Bacillus como B. cereus, B. mycoides y B. thuringiensis y de otro Pichia kudriavzevii VIT-NN02.

(a), espectrómetro FTIR de estándar PHA; (b), PHA producido por Pichia sp. TSLS24; (c), análisis HNMR del estándar PHA (Sigma); (d) PHA producido por Pichia sp. TSLS24; (e), análisis GC-MSn del estándar PHA (Sigma); (f) PHA producido por Pichia sp. TSLS24; (g), espectros de masas de PHA acumulado por TSLS24; (h), línea estándar Crotonic para medición de PHA.

La estructura monomérica del compuesto extraído por Pichia sp. TSLS24 se reveló mediante espectros de RMN de 1H y 13C como se muestra en la Fig. 2c, d. La señal a 1,2 ppm estaba relacionada con el disolvente, CDCl37. Los picos existentes a 2,4 y 2,5 ppm correspondieron al grupo metileno (–CH–(CH2)–CO–) más cercano a un átomo de carbono asimétrico con 1 protón. El espectro de RMN 1H mostró señales de los protones de metano (–CH–) a 5,2 ppm, lo que significa –O–(CH–) CH2– enlace en el carbono número 3. Sin embargo, el PHA extraído tiene varios picos pequeños a 1,9 y 4,1 ppm.

Según el análisis GC-MS, el PHA acumulado por TSLS24 tiene un tiempo de retención similar al del PHA estándar comprado a 28,3 minutos (Fig. 2e, f). En la figura 2g, los espectros de masas indicaron un ion pico base en m/z 279 con iones fragmento en m/z 167 [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–CH(CH3)–CH2C( O)]; 149 [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–CH(CH3)–CH2C–] y 113 [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–C–]. De hecho, el fragmento [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–CH(CH3)–CH2C(O)] era 172; [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–CH(CH3)–CH2C–] fue 156 y [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–C–] fue 114, pero en la cromatografía tiene sólo los m/z de 167, 149 y 113. Se podría explicar que durante el análisis, varios iones H+ en los grupos metilo desaparecieron. El tipo de PHA producido por P. kudriavzevii. Se demostró que TSLS24 mediante análisis FT-IR, NMR y GC es un homopolímero de poli (3-hidroxibutirato) (PHB) estándar.

Según Law y Slepecky25 y Lee et al.26, el PHA se complementó con H2SO4 concentrado y luego se hirvió a 100 °C durante 30 minutos para convertir el PHA en ácido crotónico. Por lo tanto, en este estudio, se utilizó PHA comercial como estándar interno/control positivo y se construyó la línea estándar de ácido crotónico. Según la línea estándar de ácido crotónico (Fig. 2h), la concentración de PHA producida por P. kudriavzevii TSLS24 se estimó en 4,57 ± 0,35 mg de una muestra de 5,0 mg (p/p). Este resultado indicó que la pureza del PHA extraído fue del 91,38% en comparación con el estándar.

La producción de PHA en microbios es un proceso complejo que se ve afectado por factores nutricionales y ambientales, incluida la temperatura, el pH, la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y la relación C/N. Por lo tanto, existe la necesidad de optimizar estos parámetros que influyen para maximizar la producción de PHA a partir de la cepa aislada.

La Pichia sp. TSLS24 se cultivó en medio ZMA a diferentes temperaturas durante 96 h. La Tabla 1 mostró que TSLS24 podía crecer bien y producir PHA en un amplio rango de temperaturas de 15 a 45 °C. Sin embargo, en el extremo superior del rango de temperatura de 40 a 45 °C, el contenido de PHA solo alcanzó el 24,3 al 26,2 % de la biomasa seca; las concentraciones de biomasa fueron 2,84 y 2,18 gL-1 y las concentraciones de PHA fueron 0,74 y 0,52 gL-1, respectivamente. La temperatura más baja a 15 °C, las concentraciones de biomasa y PHA fueron 2,55 y 0,76 gL-1. El rango de temperatura más óptimo para la producción de PHA es el de 20 a 35 °C, donde el contenido y la concentración de PHA eran superiores al 40 % y 1,12 gL-1. Con la temperatura de cultivo más óptima entre 30 y 35 °C, la concentración de biomasa obtenida fue de más de 3 gL-1 con un contenido de PHA de aproximadamente 47%. El contenido y la concentración de PHA alcanzaron un máximo de 47,5% y 1,65 gL-1 bajo una temperatura óptima de cultivo de 35 °C. Estos resultados coincidieron con otras cepas de levadura productoras de PHA, Ojha y Das19. Además, el amplio rango de temperatura viable, especialmente el extremo superior de 40 a 45 °C, así como el rango de temperatura óptimo estaban de acuerdo con estudios publicados sobre la productividad de otros compuestos en la levadura, como el HOP de Pichia kudriavzevii, tolerante al calor. -1, que según se informó era capaz de producir etanol con buena eficiencia a 40–45 °C29,37. Como resultado, se seleccionó una temperatura de cultivo de 35 °C para el experimento posterior.

Los experimentos se realizaron con un pH medio inicial de 4, 5, 6, 7, 8 y 9 de manera similar a aquellos con temperatura. Los resultados se presentan en la Tabla 2. La biomasa obtenida mostró que TSLS24 podía crecer en todos los valores de pH. Las concentraciones de biomasa de los cultivos con pH 4 y 5 fueron 0,98 y 1,26 gL−1; las concentraciones de PHA fueron 0,12 y 0,35 gL-1; igualmente al 12,2 y 27,8% del contenido de PHA, respectivamente. Con un rango de pH de 6 a 9, la acumulación de PHA en Pichia sp. TSLS24 fue alto y el valor óptimo para la producción de PHA es pH 7. A pH 7, la producción de biomasa fue la más alta (2,78 ± 0,17 gL-1) y el contenido de PHA alcanzó el máximo de 46,5%, lo que permitió que la concentración de PHA alcanzara el el más alto de 1,28 ± 0,20 gL-1. Para valores de pH ligeramente alcalinos de 8 y 9, el contenido de PHA se mantuvo en el rango de 45,8 a 46,4 %, aunque la concentración de biomasa comenzó a disminuir después del aumento de los valores de pH; en detalle, las concentraciones de biomasa fueron 2,24 y 1,84 gL-1 y PHA. las concentraciones fueron 1,02 y 0,84 gL-1.

Según otras literaturas, Pichia sp. normalmente se utilizaba en la fermentación de vino y cerveza con un pH de 3 a 429. Además, Pichia sp. es un género de levadura valioso para crear sabor y aroma a los granos de cacao a un pH de 429. En la investigación sobre la producción de PHA, se demostró que la producción de PHA se reducía significativamente a un pH ácido más bajo en comparación con un pH alcalino más alto, donde era estable19,38. Nuestra observación en el presente estudio mostró que Pichia sp. TSLS24 también podría crecer bien en rangos de pH más altos de 6 a 9 y tener una alta productividad de PHA y el pH óptimo fue 7. Se han publicado resultados similares para Alcaligenes latus que alcanzó una producción de PHB de 10,30 ± 1,01 gL-1 con el pH óptimo. oscila entre 6,0 y 7,539. Según el resultado de la optimización, se utilizó un pH de 7 para los experimentos posteriores.

Los microbios pueden utilizar diferentes fuentes de carbono para su crecimiento y síntesis de precursores de PHA. Estos precursores podrían polimerizarse aún más en PHA dependiendo de las vías metabólicas. Microbios como Pseudomonas sp., Halomonas sp y Cupravidus sp. Se informó que eran las mejores cepas para la producción de PHA al utilizar azúcares de seis carbonos, por ejemplo, glucosa, celulosa, fructosa, manosa, galactosa y maltosa, basadas en la vía de la glucólisis5,6. También se informó que la lactosa se utiliza en la producción de PHA y biohidrógeno mediante una fermentación en dos pasos de suero de queso desproteinizado, en el que la lactosa es uno de los componentes principales40. Los azúcares de cinco carbonos también se pueden utilizar a través de la vía de las pentosas fosfato; sin embargo, solo hay unos pocos microbios que podrían convertir eficientemente dichos azúcares en PHA debido al hecho de que la mayoría de las cepas productoras de PHA que preferían los azúcares de 6 carbonos tienen bajos niveles de 5 carbonos. actividades metabólicas del azúcar41. En un caso raro, se informó que Burkholderia sacchari DSM 17165 podía producir PHA de manera efectiva con xilosa y arabinosa como fuentes de carbono41. Por lo tanto, en la presente investigación, se emplearon 20 gL-1 de azúcares de seis carbonos, incluidas glucosa, manitosa, lactosa, almidón o sacarosa, como fuente de carbono en medio ZMA con pH de cultivo y temperatura de pH 7 y 35 °C.

La Tabla 3 demostró que todas las fuentes de carbono investigadas son adecuadas para el crecimiento de la levadura y la producción de PHA. Entre ellos, la glucosa es la mejor fuente de carbono para la producción de PHA con una concentración y un contenido de PHA de 1,43 ± 0,07 gL-1 y 50,5%. Las otras fuentes de carbono como lactosa, sacarosa, almidón y manitosa provocaron una cantidad de biomasa de 2,66, 2,42, 2,19 y 2,55 gL-1; y PHA a 1,26, 1,08, 0,97 y 0,99 gL-1, respectivamente. La flexibilidad de TSLS24 para utilizar diferentes fuentes de carbono está de acuerdo con estudios previos. Se informó que P. kudriavzevii era una levadura que podía utilizar de manera flexible diversas fuentes de carbono, como glucosa, sacarosa, galactosa, fructosa y manosa29. Además, se informó que la levadura marina P. kudriavzevii VIT-NN02 podía utilizar de manera eficiente las cáscaras de plátano de desecho como fuente de carbono para la producción de PHA y alcanzó un contenido de PHA del 79%19. Además, la levadura Wickerhamomyces anomalus VIT-NN01 aislada del jugo de caña de azúcar utilizó fuentes de carbono baratas, como melaza de caña de azúcar, aceite de palma y licor de maceración de maíz, para producir PHA con un rendimiento de PHA de 19,05 ± 0,3 gL-1 obtenido después de 96 h de cultivo38.

En general, el nitrógeno es un nutriente crucial para el crecimiento de cualquier microbio. La síntesis de PHA en microbios es sensible al nitrógeno y la mayoría de las cepas productoras de PHA tienen diferentes preferencias de fuentes de nitrógeno. como amoníaco, urea y nitrato42. Por lo tanto, la selección de fuentes y concentraciones de nitrógeno es muy importante para el crecimiento de microorganismos y la producción de PHA. En el presente estudio, se examinó el cultivo de P. kudriavzevii TSLS24 con diferentes fuentes de nitrógeno, incluidas fuentes orgánicas e inorgánicas (Tabla 4).

Entre las fuentes de nitrógeno analizadas, el extracto de levadura demostró ser la fuente de nitrógeno más adecuada para la producción de PHA por P. kudriavzevii TSLS24 (contenido de PHA del 55,2%), seguido de la peptona (54,6%), el sulfato de amonio (NH4)2SO4 ( 31,6%), nitrato de amonio (NH4NO3) (26,1%), cloruro de amonio (NH4Cl) (24,9%) y urea (18,5%). Según los hallazgos, el cultivo de TSLS24 con fuentes orgánicas como peptona y extracto de levadura produjo una mayor producción de biomasa (2,66–2,70 gL-1) y contenido de PHA (54,6–55,2%) en comparación con fuentes de nitrógeno inorgánico (0,24–1,42 gL-1). y 18,5–31,6%). También se han empleado fuentes de nitrógeno orgánico para el cultivo de Pichia sp. Como informaron Ojha y Das19,38, el licor de maceración de maíz y el hidrolizado de plumas de pollo se han utilizado como fuente barata de nitrógeno para el cultivo de Wickerhamomyces anomalus VIT-NN01 y Pichia kudriavzevii VIT-NN02, respectivamente, para la producción de PHA. Estos resultados sugirieron que podría ser interesante examinar la producción de PHA de Pichia sp. TSLS24 utiliza fuentes de nitrógeno orgánico económicas, como licor de maíz, salvado de trigo, plumas de pollo y otros.

Se demostró que la proporción C:N afecta el crecimiento de la levadura y la producción de PHA19. La razón es que cuando la fuente de carbono en el medio de cultivo es excesiva mientras que uno de los otros factores nutricionales, por ejemplo, N, S, P es limitado, la levadura sería estimulada para producir PHA en forma de gránulos de almacenamiento de carbono dentro de la célula. En una condición de deficiencia de nitrógeno, los microbios tienden a reducir las actividades de producción de proteínas microbianas, junto con una mayor síntesis de PHA para almacenarse como una importante fuente de energía de reserva43,44. Por lo tanto, en esta investigación, se evaluó el efecto de la relación C:N en la producción de PHA por TSLS24 de P. kudriavzevii con glucosa y extracto de levadura como fuentes de carbono y nitrógeno. Se fijó la concentración de glucosa pero se cambiaron las concentraciones de extracto de levadura.

La Tabla 5 demostró que 20:1 era la relación C:N más eficaz para el crecimiento celular y la producción de PHA, alcanzando un contenido y una concentración de PHA del 50,9 % y 1,53 ± 0,11 gL-1. Sin embargo, no hay diferencias significativas entre todos los ratios examinados. Los resultados del presente estudio coincidieron con los de Wang et al.44, en los que se informó una reducción del contenido de PHA en la biomasa en condiciones ricas en nitrógeno. En general, la preferencia de la relación C/N varía según el tipo de cepa, fuente de carbono y nitrógeno. Se informaron diferentes proporciones óptimas de C/N para la producción de PHA en varios microbios, como 40:1 para Pseudomonas mendocina45, 21:1 para Alcaligenes denitrifcans A4146 y 15:1 para Bacillus megaterium47. También se informó que la relación C/N de 20:1 es óptima para la acumulación de poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxihexanoato hasta un 67% en peso en Ralstonia eutropha utilizando aceite residual de café como fuente de carbono y cloruro de amonio como fuente de nitrógeno48 . En Haloferax mediterranei, se informó que la relación C/N podría afectar la capacidad de producción simultánea de PHA y exopolisacáridos (EPS), donde el ajuste de la relación C/N afecta la proporción de PHA y EPS sintetizados. Con una relación C/N más alta de 30, el PHA fue el producto principal, mientras que con una relación C/N más baja de 10, se produjo principalmente EPS38. Se seleccionó la relación C/N de 20:1 para el experimento posterior (archivo complementario 1).

Pichia kudriavzevii TSLS24 se cultivó en condiciones óptimas de pH 7, 35 °C con 20 g/L de glucosa y 1 g/L de extracto de levadura. La fermentación se realizó con diferentes volúmenes operativos de 200, 500, 1000, 2000 y 5000 ml durante 10 días. Después de cada 3 h de cultivo, se suplementaron 10 gL-1 de glucosa para proporcionar redundancia de glucosa y garantizar la limitación de nitrógeno, lo que estimuló a la cepa a producir PHA.

En la Tabla 6, se puede observar que el contenido y la concentración de PHA se mantuvieron en el rango de 46,3 a 52,9 % y de 1,72 a 1,84 gL-1 independientemente del volumen de fermentación. Cuando el volumen de fermentación alcanzó los 5000 mL, la producción de PHA alcanzó 1,79 gL-1 con una concentración de biomasa de 3,42 gL-1, logrando un contenido de PHA de hasta 52,9%. Por lo tanto, P. kudriavzevii TSLS24 podría ser más adecuado para la fermentación a mayor escala, por ejemplo, a escala piloto que a escala de laboratorio.

Recientemente, existen varios informes sobre microorganismos productores de PHA como Bacillus, Clostridium, Mycobacterium, Streptomyces, Fusobacterium, Burkholderia, Pseudomonas, Bordetella, Neisseria, Agrobacterium, Rhizobium, Ralstonia, Vibrio, Legionella, Acinetobacter, Sphingomonas, Rickettsia48,49 ,50. Las cepas de levadura genéticamente modificadas como Kloeckera sp., S. cerevisiae, Y. lipolytica, P. pastoris y Rhodotorula minuta cepa RY4 también fueron reportadas como productoras de PHA11,13,15,16. En 2018, Ojha y Das exploraron una posible cepa de levadura Wickerhamomyces anomalus aislada de fuentes naturales. Aunque la información sobre la levadura productora de PHA halófilo es limitada, la levadura es una opción potencial para la producción de PHA a escala piloto28.

El estudio de la biodegradación es crucial para comprender la tasa de degradación de los materiales plásticos y los mecanismos implicados. Los resultados del estudio de degradación mostraron que después de 28 días, el peso de la película de PHA en el grupo control (sin microorganismos) no cambió, mientras que el peso se redujo en un 28% y un 19,5% en el grupo experimental inoculado con TSLS24 y el grupo que usó natural. agua de mar sin purificar. Las estructuras de las películas de PHA se observaron y analizaron mediante SEM (Fig. 3). Las estructuras de la película de PHA inoculada con TSLS24 experimentaron cambios significativos donde el TSLS24 rompió los enlaces entre las moléculas (Fig. 3d), mientras que la estructura del control sin microbio se mantuvo estable (Fig. 3b) y la estructura de la película de PHA se complementó. con agua de mar natural se vio ligeramente alterado (Fig. 3c). La película de PHA extraída también se degradó en agua de mar como bioatenuación. Los resultados sugirieron que el PHA producido por la cepa TSLS24 podría degradarse fácilmente en un ambiente salino (agua de mar) por los microbios naturales que existen en el ambiente. En comparación con la degradación en el suelo y el compost, la degradación de los plásticos en el agua de mar es más compleja debido a la baja temperatura, la alta salinidad, la alta presión, las corrientes y los bajos niveles de nutrientes (por ejemplo, nitrato) del medio marino, sin mencionar la variación. entre diferentes estaciones, diferentes regiones o la profundidad/presión en la dirección vertical que afecta al menos a la temperatura del agua. Por lo tanto, se requieren investigaciones y evaluaciones en profundidad para proporcionar una base crucial antes de cualquier aplicación práctica adicional.

(a), muestra de PHA producida por Pichia sp. TSLS24; Cambios en la estructura de las membranas de PHA después de 28 días bajo TEM, aumento de 2000X: (b) Muestra de PHA de control intacta incubada en agua de mar estéril sin microbios; (c) muestra de PHA degradada por microbios naturales en agua de mar no esterilizada; (d) Muestra de PHA degradada por Pichia sp. TSLS24 en agua de mar esterilizada.

Desde 1992, algunos estudios fundamentales han informado de la degradación de los PHA en el agua de mar44,51. El mecanismo de degradación de los PHA en el agua de mar siguió a la erosión de la superficie, como también se informó en el suelo y el compost. Sin embargo, la tasa de degradación de los PHA en el agua de mar fue significativamente más lenta. La tasa de degradación promedio de PHA en el océano se determinó entre 0,04 y 0,09 mg día-1 cm-2, donde el espesor y la forma geométrica del producto podrían afectar el tiempo requerido para la degradación. Para las bolsas de plástico de 0,035 mm de espesor, se informó que el tiempo para la degradación completa oscilaba entre 25 días y 2 meses, mientras que una botella de plástico de 0,8 mm de espesor solo podía degradarse completamente después de al menos 1,5 años1.

En la presente investigación, una cepa de levadura halófila Pichia sp. TSLS24 aislado de la isla Spratly en Vietnam mostró su capacidad para crecer y producir PHA de manera eficiente en un amplio rango de temperatura de 15 a 45 °C, un amplio rango de pH de 6 a 9, fuentes de carbono flexibles como glucosa, manitosa, lactosa y almidón. y sacarosa, así como diferentes fuentes de nitrógeno. La eficiencia de la producción de PHA en diferentes volúmenes de fermentación fue estable y alcanzó un alto contenido de PHA del 52%. El PHA extraído era homólogo con alta pureza (91,4%) y se confirmó como PHB comprado mediante análisis FTIR, RMN y GC-MS. y el PHA acumulado puede ser fácilmente biodegradado por organismos naturales, incluso en condiciones extremas como en el agua de mar. Los trabajos futuros incluyen la optimización de la extracción y producción de PHA a escala piloto o in vivo. Los resultados proporcionan información sobre la producción de PHA por P. kudriavzevii TSLS24. Especialmente, el TSLS24 podría usarse para producir PHA en un entorno insular y el PHA podría usarse para reemplazar otros materiales plásticos.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio OL757724, enlace: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OL757724.

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Este trabajo fue financiado por el proyecto de la Academia de Ciencia y Tecnología Militar en 2021: “Estudio sobre la producción de bioplásticos biodegradables en condiciones marinas e insulares”.

Estos autores contribuyeron igualmente: Nguyen Viet-Linh y Le Thi Nhi-Cong.

Instituto de Nueva Tecnología, Academia de Ciencia y Tecnología Militar, Hanoi, 10072, Vietnam

Nguyen Thi Tam Thu, Le Huy Hoang y Pham Kien Cuong

Instituto de Biotecnología, Academia de Ciencia y Tecnología de Vietnam, 18 Hoang Quoc Viet, CauGiay, Hanoi, 10072, Vietnam

Nguyen Viet-Linh y Le Thi Nhi-Cong

Universidad de Graduados en Ciencia y Tecnología, Academia de Ciencia y Tecnología de Vietnam, Hanoi, 10072, Vietnam

Nguyen Viet-Linh y Le Thi Nhi-Cong

Universidad de Ciencias, Universidad Nacional de Vietnam-Hanoi, Hanoi, 11400, Vietnam

Tran Thi Huyen Nga

Instituto de Tecnología Ambiental, Academia de Ciencia y Tecnología de Vietnam, Hanoi, 10072, Vietnam

Dang Dinh Kim

Departamento de Ingeniería Química y de Materiales, Universidad de Tunghai, Taichung, 407224, Taiwán

Yoong Kit Leong

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

NTTT: Conceptualización, Adquisición de fondos, Administración de proyectos. LHH: Metodología, Curación de datos, PKC: Investigación de visualización, Escritura Preparación del borrador original NV-.L.: Software, Validación, Escritura - Revisión y edición TTHN: Investigación de visualización, Metodología, DDK: Curación de datos, Validación YKL: Revisión y edición LTN -.C.: Conceptualización, Redacción-Revisión y Edición.

Correspondencia a Nguyen Viet-Linh o Le Thi Nhi-Cong.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Thu, NTT, Hoang, LH, Cuong, PK et al. Evaluación de la síntesis de polihidroxialcanoato (PHA) por Pichia sp. Levadura TSLS24 aislada en Vietnam. Representante científico 13, 3137 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28220-z

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Recibido: 08 de septiembre de 2022

Aceptado: 16 de enero de 2023

Publicado: 23 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28220-z

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